Новости России и Мира

6 декабря






Рейтинг@Mail.ru


Систему CRISPR-CAS9 удалось заснять в действии

Рис. 1. Механизм работы системы Crispr-Cas. 1 — участок ДНК вируса, который клетка встретила впервые (красный), вставляется в локус CRISPR, где уже хранятся участки ДНК вирусов, которые клетка встречала ранее (разноцветные стрелки). 2 — на основе библиотеки CRISPR создаются направляющие РНК, которые образуют комплекс с белком Cas (лиловые овалы). 3 — Когда комплекс Cas-РНК встречает вирусную ДНК (зеленая), комплементарную направляющей РНК, он соединяется с ней и уничтожает, разрезая на части. Изображение с сайта gesundheitsindustrie-bw.de

Несмотря на уже более чем десятилетнюю историю изучения системы CRISPR-Cas и применения ее для редактирования генома, до сих пор никто не наблюдал ее за работой. Японские ученые устранили этот пробел и первыми в мире получили видео этого процесса, используя высокоскоростной атомно-силовой микроскоп. При этом выяснилось, что элементы системы связываются с молекулами ДНК не так, как считалось ранее: они не ползают по этим молекулам в поисках нужного места, а находят его при помощи трехмерной диффузии.

Система CRISPR-Cas9, которая используется для направленного редактирования генома, завоевала большую популярность среди ученых. Количество статей, в которых упоминается эта система, стремительно растет с каждым годом (начиная с нескольких статей в 2011 году и заканчивая более чем двумя тысячами статей в 2017 году).

Напомним, что CRISPR-Cas — это иммунная система бактерий. Подобно нашей иммунной системе, в которой есть: 1) клетки памяти, задача которых — запомнить «врага» в лицо и сохранить информацию о нем (например, особая популяция лимфоцитов хранит информацию о ранее использованном оружии против возбудителя инфекции и формирует вторичный иммунный ответ); 2) клетки, которые непосредственно будут бороться с врагом (например, Т-киллеры); у бактерий тоже есть механизм, направленный на уничтожение возбудителей инфекций. Только у бактерий за иммунитет отвечают не отдельные клетки, а специально приспособленные для этого нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) и белки. В основе иммунной системы бактерии лежит CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) — комплекс повторяющихся участков ДНК. Между ними находятся спейсеры — разделители с геномными фрагментами вирусов — генетическими «портретами» тех, с кем эта бактерия уже сталкивалась. Это — своеобразная база фотороботов нарушителей в геноме бактерии.

Работает она так. Если в бактерию попал вирус, который она до этого не встречала, и ей удалось его побороть, то на память она оставит небольшой кусок вирусной ДНК, который будет сохранен в локусе CRISPR (рис. 1). После этого необходимо перевести полученную от вируса последовательность нуклеотидов в форму, способную нацеливать белки Cas. Для этого создается так называемая направляющая РНК (gRNA), которая повторяет вставленный в базу кусок вирусной ДНК. Как правило, направляющие РНК создаются постоянно и с довольно низкой скоростью, но при столкновении клетки с вирусом или в стрессовых условиях скорость значительно увеличивается. После того, как РНК создана, она связывается с комплексом белков Cas. Теперь комплекс Cas-gRNA подобно полицейскому с фотороботом преступника, может патрулировать клетку. Когда найден кусок чужеродной ДНК, комплементарный направляющей РНК, комплекс связывается с этим куском и белки Cas расщепляют его, как пара молекулярных ножниц. Подробнее об этом молекулярном механизме см., например, статью Д. Э. Джагарова Умные ножницы для ДНК.

Открытая почти 30 лет назад, более 20 лет эта система представляла интерес только для молекулярных биологов, которые пытались понять свойства этого уникального защитного механизма. В 2012 году был выявлен потенциал систем CRISPR-Cas9 как инструмента для редактирования генома, способного инициировать целенаправленные генетические модификации практически в любом организме. В последующие годы с помощью этого метода ученым удалось, например, избавить мышей от генетических заболеваний (J. R. Mendell, L. R. Rodino-Klapac, 2016. Duchenne muscular dystrophy: CRISPR/Cas9 treatment), вылечить животных от ВИЧ (C. Yin et al., 2017. In Vivo Excision of HIV-1 Provirus by saCas9 and Multiplex Single-Guide RNAs in Animal Models) и даже отредактировать геномы эмбриона и взрослого человека (см. P. Liang et al., 2015. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes и популярную заметку D. Cyranoski Chinese scientists to pioneer first human CRISPR trial). Об истории и основных результатах применения этого метода читайте в новости Подведены итоги первого десятилетия изучения CRISPR («Элементы», 13.07.2017).

Несмотря на существенные успехи, по сей день не было ни одного прямого наблюдения функционирования этой системы. Этот пробел удалось устранить группе японских ученых во главе с Микихиро Шибатой (Mikihiro Shibata) при помощи высокоскоростного атомно-силового микроскопа (HS-AFM), который позволяет получать изображения молекул и даже отдельных атомов. Статья об исследовании опубликована в журнале Nature Communications.

С помощью HS-AFM-визуализации можно выявлять динамику белков с фантастической детализацией. Например, ранее ученым, среди которых были и некоторые авторы обсуждаемой работы, удалось зафиксировать фотоиндуцированные конформационные изменения в молекуле бактериородопсина (M. Shibata et al., 2010. High-speed atomic force microscopy shows dynamic molecular processes in photoactivated bacteriorhodopsin) и пронаблюдать за молекулой миозина, прогуливающейся по актиновой нити (N. Kodera et al., 2010. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy).

Принцип работы атомно-силового микроскопа основан на межмолекулярном взаимодействии между поверхностью исследуемого образца и зондом. Зонд — это наноразмерное острие, которое находится на конце упругой консоли, кантилевера. Сканируемая поверхность может притягивать или отталкивать зонд, что приводит к изгибу кантилевера (рис. 2). Этот изгиб регистрируется при помощи лазера, который, отражаясь от кантилевера, попадает на чувствительный фотодетектор (подробности — в статье А. Курамшина Взгляни на атомы, прикоснись к молекуле). Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия работает по такому же принципу. Разница лишь в том, что используется кантилевер, который в тысячи раз меньше, чем используемый в классической АСМ, что позволяет увеличить скорость получения изображений.

Рис. 2. Схема работы атомно-силового микроскопа. Изображение с сайта simple.wikipedia.org

Ученые сами подготовили необходимые молекулы для исследования. Белок Cas9 был синтезирован в клетках кишечной палочки E. Coli, а затем был очищен с помощью колоночной хроматографии. Направляющую РНК и ДНК-мишень синтезировали in vitro. Помимо этого, была подготовлена специальная подложка, на которой впоследствии размещали биополимеры. К подложкам, используемым для АСМ выдвигаются следующие требования: поверхность должна быть достаточно ровной и хорошо адсорбировать исследуемые объекты. При сканировании биомолекул чаще всего используются подложки из слюды. И хотя такие подложки имеют гидрофильную поверхность с атомарно-ровными участками размером более 100 мкм, они обладают рядом недостатков, — например, отрицательным зарядом поверхности (что может помешать в работе с ДНК, поскольку фосфатные группы также имеют отрицательный заряд) и способностью подавлять свободную диффузию комплексов. Для преодоления этих недостатков исследователи модифицировали поверхность слюды двумя разными способами: 1) обрабатывали поверхность слюды раствором APTES ((3-аминопропил)триэтоксисилан), в результате чего на поверхности слюды образовывалась пленка, которая в воде имеет положительный заряд. 2) формировали липидный бислой на поверхности слюды, за счет чего минимизировались взаимодействия между комплексом Cas9-РНК и слюдой.

Первое, что сделали японские ученые, — это попробовали заснять белок Cas9 без направляющей РНК. Ранее изменения в белке Cas 9, происходящие во время его работы, изучались с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА). Этот метод позволяет получить трехмерную структуру молекулы, например, белка (см. А. Оганов, 10 фактов о кристаллографии). Если коротко, то процесс получения изображения этим методом состоит из таких этапов: изготовление насыщенного раствора белка, который прошел очистку, процесс кристаллизации образца, сбор данных рассеивания рентгеновских лучей и непосредственно обработка данных, включающая в себя компьютерное моделирование.

Предыдущие исследования показали, что молекула Cas9 в свободном состоянии имеет жесткую структуру. Чтобы проверить это, японские ученые взяли кристаллические модели, полученные другой группой исследователей, и сравнили их со своими изображениями, полученными на АСМ. Оказалось, что свободный белок имеет подвижную структуру, отличную от жесткой структуры, наблюдаемой в кристалле (рис. 3, b, c). То есть данные, полученные ранее с помощью РСА оказались нерелевантными, так как не соответствуют структуре белка в естественном состоянии.

Рис. 3. b- Кристаллические структуры, слева направо: одинокий Cas9, комплекс Cas9-РНК, Cas9-РНК, связанный с одноцепочечной ДНК-мишенью, и Cas9-РНК, связанный с его мишенью (двуцепочечной ДНК). Разными цветами обозначены функциональные домены белка: серо-белый кусок — альфа-спиральная лопасть, розовый — нуклеазный домен HNH, который расщепляет мишень ДНК, голубой — нуклеазный домен RuvC, который расщепляет цепь нецелевой ДНК, бежевый — PAM домен, распознающий специальный кусок ДНК-мишени. c и d — последовательные изображения, полученные с помощью высокоскоростного атомно-силового микроскопа: одинокий Cas9 (c) и комплекс Cas9-РНК ( d ). Маленький хвостик, указанный стрелкой, это кусочек РНК, торчащий из альфа-спиральной лопасти. Шкалы справа показывают высоту объекта над подложкой. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature Communications

Затем исследователи засняли комплекс Cas9 с направляющей РНК. В отличие от одинокого белка, комплекс Cas9-РНК имел стабильную двулопастную архитектуру, соответствующую кристаллической структуре (рис. 3, b, d, см. также видео №2 из дополнительных материалов к обсуждаемой статье).

Следующим шагом стала визуализация связывания комплекса Cas9-РНК с ДНК-мишенью. Для начала на поверхность подложки адсорбировали всех «участников»: молекулярные комплексы Cas9-РНК и ДНК-мишени. На видео можно заметить, что комплекс Cas9-РНК специфически связывается со своей ДНК-мишенью. Все это было проведено в отсутствие ионов магния Mg2+. Ионы этого металла необходимы для правильной работы нуклеаз, поэтому без магния комплекса связывается с ДНК, но дальнейшего расщепления не происходит (рис. 4, см. также видео №3 из дополнительных материалов к обсуждаемой статье).

Рис. 4. Комплекс Cas9-РНК, специфически (то есть в конкретном месте, в котором будет происходить разрезание) связанный со своей мишенью в отсутствие ионов Mg2+, не разрезает ДНК. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature Communications

Чтобы визуализировать процесс разрыва ДНК, исследователи повторили предыдущий шаг, но уже добавили магний. Тогда белок Cas9 смог разрезать ДНК. На видео продемонстрировано, как после внесения двухцепочечных разрывов часть ДНК высвобождается из комплекса (рис. 5 и видео).

Рис. 5. Комплекс Cas9-РНК в присутствии ионов Mg2+ разрезает ДНК. Белые и розовые стрелки указывают на нуклеазный домен NHN в неактивном и активном состоянии. Высвобожденный конец нити ДНК показан голубой стрелкой на последнем кадре. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature Communications

Комплекс Cas9-РНК разрезает молекулу ДНК

Из-за недостаточного разрешения изображений, к сожалению, осталось неизвестным, как освобождается оставшаяся в комплексе часть молекулы ДНК.

Также ученым удалось опровергнуть теорию о том, как именно комплекс Cas9-РНК связывается с необходимым участком на молекуле ДНК: ранее считалось, что белок, связанный с РНК, «скользит» по ДНК в поисках комплементарного участка. Для этого исследователи использовали подложку с билипидным слоем, чтобы минимизировать взаимодействие между слюдой и белком, которое может помешать свободной диффузии комплекса. Оказалось, что Cas9 без направляющей РНК связывается с молекулой ДНК и просто скользит по ней. А вот когда у белка есть РНК, комплементарная нужному участку, комплекс не скользит, а напрямую связывается с мишенью (рис. 6, см. также видео №7 из дополнительных материалов к обсуждаемой статье). Видимо, наличие направляющей РНК мешает комплексу Cas9-РНК «оседлать» ДНК, чтобы скользить по ней. Так что связывание происходит за счет трехмерной диффузии: комплексы плавают в растворе, а если им повезет оказаться рядом с нужным участком ДНК, то они с ним связываются.

Рис. 6. a — несколько белков Cas9 (отмечены стрелками), у которых отсутствует направляющая РНК, скользят по молекуле ДНК. b — комплекс Cas9-РНК сразу же связывается с нужным участком, как только оказывается рядом с ним из-за трехмерной диффузии. На втором кадре видно несколько молекул ДНК, на одной из которых уже сидит комплекс Cas9-РНК (нижняя стрелка), а на другой отмечено место, с которым впоследствии свяжется другой комплекс (верхняя стрелка). На четвертом и пятом кадрах хорошо видно, что Cas9-РНК появляется в нужном месте сразу, а не скользит по ДНК. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature Communications

Эти зернистые и, казалось бы, неказистые видео заставляют ученых по всему миру задыхаться от восторга. С одной стороны система CRISPR-Cas9 работает так, как и предсказывали ранее. С другой стороны, уже выявились новые подробности в том, как белковый комплекс связывается с правильным участком ДНК. В целом же это исследование предоставляет беспрецедентные подробности о функциональной динамике CRISPR-Cas9 и подчеркивает потенциал высокоскоростной атомно-силовой микроскопии для выяснения механизмов действия молекул, ассоциированных с нуклеиновыми кислотами.

0
 

Коментарии:

пока нет, но вы всегда можете оставить свой.

Оставить комментарий:
captcha
Администрация оставляет за собой право удалять любые комментарии по следующим причинам:
  • Отзыв является спамом или содержит сомнительную информацию.
  • Отзыв содержит ненормативную лексику.
  • Отзыв является оскорбительным, унижающим честь и достоинство конкретных людей.
  • Сообщить о нарушении вы можете здесь