Новости России и Мира

5 февраля






Рейтинг@Mail.ru


Найдены регуляторные гены, останавливающие спорообразование у дрожжей Cryptococcus neoformans

Рис. 1. Базидии на концах гиф C. neoformans со спорами (слева) и без спор (справа). Рисунок из обсуждаемой статьи в eLife Sciences

Секрет успеха некоторых патогенных грибов — половое размножение, которое приводит к генетической рекомбинации и позволяет организмам развивать высокую лекарственную устойчивость. Таким свойством обладает Cryptococcus neoformans, возбудитель инфекционного менингоэнцефалита у человека, уносящего ежегодно более 600 тысяч жизней по всему миру. Выживать в неблагоприятных условиях среды и распространяться грибку позволяют споры, для формирования которых необходимо два тесно связанных процесса — созревание спорообразующей клетки (базидии) и мейоз. Новое исследование выявило два регуляторных гена, которые ответственны за координацию этих процессов. Отключение этих генов полностью останавливает процесс спорообразования, что может помочь в поиске новых способов остановить распространение Cryptococcus neoformans.

Cryptococcus neoformans — вид дрожжевых грибов из отдела Базидиомицетов. В 1894 году его клетки впервые выделили из ферментированного персикового сока (F. Sanfelice, 1894. Contributo alla morphologia e biologia dei blastomiceti che si sviluppano nei succhi di alcuni frutti). В том же году клетки криптококка были найдены в опухоли, которая поразила большую берцовую кость молодой женщины (O. Busse, 1894. Uber parasitare Zelleinschlusse und ihre Zuchtung). Спустя еще полвека C. neoformans был обнаружен во внешней среде: в 1951 году в штате Вирджиния он был выделен из проб почвы (C. W. Emmons, 1951. Isolation of Cryptococcus neoformans from soil).

Грибок C. neoformans — возбудитель криптококкоза. До 70-х годов XX века он считался редким заболеванием, однако развитие иммуносупрессивной терапии и рост количества ВИЧ-инфицированных привели к тому, что уже к середине 80-х годов заболеваемость криптококкозом заметно выросла. По оценкам 2009 года в мире было больше 950 000 новых случаев заболевания криптококкозом в год и более 600 000 случаев смерти от него (B. J. Park et al., 2009. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS). Люди с иммунодефицитом — основная группа риска, но этому заболеневанию подвержены все, у кого по разным причинам подавлен иммунитет (например, из-за длительной терапии кортикостероидами, трансплантации органов, злокачественных новообразований, диабета и т. д.). Отмечаются и случаи криптококкоза у здоровых людей, хотя, возможно, эти пациенты на момент заражения были не здоровы, а «недостаточно обследованы» и имели какие-то нарушения в работе иммунной системы (T. Saijo et al., 2014. Anti-Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Autoantibodies Are a Risk Factor for Central Nervous System Infection by Cryptococcus gattii in Otherwise Immunocompetent Patients). От криптококкоза страдают не только люди, но и другие млекопитающие.

Заражение криптококкозом происходит воздушно-пылевым путем: при вдыхании мелких спор гриба или его высохших клеток (рис. 2). C. neoformans — факультативный паразит, природным резервуаром криптококков является помет птиц (в первую очередь, голубей), а также почва. Однако C. neoformans не относится к нормальной почвенной микрофлоре. Исследования показали, что споры и клетки гриба выделяют из субстратов на территориях с высокой численностью голубей, кур, индеек и т. д.: в помете грибы ведут сапротрофный образ жизни, размножаются и сохраняют жизнеспособность до двух лет. До сих пор неясны причины такой связи: дело в том, что те же голуби довольно редко бывают инфицированы криптококками из-за высокой температуры тела (41–42 °С), которая некомфортна для C. neoformans. Правда, анализы показывают, что криптококки в большом количестве присутствуют на клювах и ногах птиц (M. L. Littman, R. Borok, 1968. Relation of the pigeon to cryptococcosis: Natural carrier state, heat resistance and survival of Cryptococcus neoformans), а также в зерне, которое они едят (Z. U. Khan, et al., 1977. Carriage of Cryptococcus neoformans in the crops of pigeons), позволяет предположить, что грибы могут попадать в организм птиц с кормом. Не так давно появились сообщения и о выделении C. neoformans из коры и гниющей древесины нескольких десятков видов деревьев (T. G. Mitchell et al., 2011. Environmental Niches for Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii) — возможно найден второй природный резервуар криптококкоза.

Рис. 2. Схема развития криптококкового менингоэнцефалита. Клетки криптококка вдыхаются человеком и размножаются в легких (указаны черными стрелками на фото вверху-справа), а затем с кровотоком распространяются в ЦНС. Рисунок из статьи K. J. Kwon-Chung et al., 2014. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the Etiologic Agents of Cryptococcosis.

Но как же C. neoformans встал на путь паразитизма? Возможно, ответ на этот вопрос дадут экологические связи этого грибка с другими обитателями почвы, в частности — с амебами. Еще в 1931 году были описаны дрожжевые клетки криптококка, выделенные из почвенной амебы Acanthamoeba castellani. Есть предположение (J. N. Steenbergen et al., 2001. Cryptococcus neoformans interactions with amoebae suggest an explanation for its virulence and intracellular pathogenic strategy in macrophages), что именно адаптация к выживанию в организме амеб позволила ему приспособиться к роли паразита млекопитающих (в частности, человека) и, в первую очередь, к выживанию и размножению внутри макрофагов.

При вдыхании споры/дрожжевые клетки попадают в верхние дыхательные пути, а оттуда благодаря своим весьма небольшим размерам (1,5–3,5 мкм) — в легкие. У здорового человека с нормально функционирующей иммунной системой клетки грибов на этом этапе элиминируются альвеолярными макрофагами. Но если иммунитет подавлен или ослаблен, то иммунных клеток слишком мало, чтобы остановить распространение относительно устойчивого к ним возбудителя, и в результате в легких формируются очаги воспаления. Грибы быстро размножаются, а затем с кровотоком попадают в центральную нервную систему. При этом длительное время развитие инфекции может протекать бессимптомно. Чаще всего заболевание обнаруживается заболевание именно на этапе поражения головного и спинного мозга, где C. neoformans вызывает менингоэнцефалит, что нередко приводит к смерти.

Высокую вирулентность C. neoformans определяют два основных фактора — наличие у его клеток полисахаридной капсулы и синтез в них меланина. Толстая полисахаридная капсула (рис. 3) защищает клетки гриба от разрушения макрофагами. Благодаря этой особенности поглощенные грибные клетки могут выживать и даже размножаться внутри макрофагов. Меланин — это высокомолекулярный пигмент, который образуется в результате полимеризации полифенолов. У C. neoformans меланин накапливается в клеточной стенке, что позволяет нейтрализовывать высокоактивные свободные радикалы — основное оружие макрофагов (Y. Wang et al., 1995. Cryptococcus neoformans melanin and virulence: mechanism of action).

Рис. 3. Слева — строение клетки C. neoformans; рисунок с сайта scq.ubc.ca. Справа — микрофотография клеток C. neoformans. Хорошо заметна толстая полисахаридная капсула. Фото с сайта en.wikipedia.org

Другой важный фактор вирулентности C. neoformans — его способность к быстрому росту и размножению при температуре тела млекопитающих. Род Criptococcus насчитывает около 70 видов с полисахаридной капсулой и синтезом меланина, но только C. neoformans и C. gattii (раньше считался подвидом C. neoformans) — факультативные паразиты человека — могут успешно существовать при температуре 37°С. Наконец, криптококки производят ферменты уреазу и фосфолипазу B. Уреаза дает грибку возможность преодолевать гемато-энцефалический барьер. Фосфолипаза B участвует в гидролизе клеточных мембран путем разрушения фосфолипидов и обеспечивает грибку проникновение в ткани хозяина. Кроме того, этот фермент увеличивает адгезию клеток криптококка на легочном эпителии, а это первый шаг к развитию легочного криптококкоза.

Если взглянуть на C. neoformans под микроскопом, можно увидеть дрожжевые клетки округлой или овальной формы со следами почкования. В тканях криптококк быстро размножается — каждая клетка образует одну или две дочерние клетки (почки), которые связаны с родительской клеткой основанием. Но самое интересное в жизненном цикле C. neoformans — половое размножение, в ходе которого споры образуются в особой шарообразной структуре — базидии. Большинство грибов-возбудителей заболеваний человека продуцирует споры в ходе бесполого размножения. Споры же криптококка, напротив, — продукт мейотической рекомбинации генетического материала, что определяет их невероятную лекарственную устойчивость.

Исследователи из Китая обратили свое внимание на генетическую регуляцию ключевых событий полового процесса у C. neoformans. Изучение этого явления необходимо для поиска способов торможения процесса образования инфекционных спор. Половое размножение у C. neoformans начинается со слияния двух клеток, имеющих гаплоидный набор хромосом. У криптококка есть клетки двух типов спаривания, которые обозначаются буквами «a» и «α». Они различаются между собой по одному локусу, mat (англ. mating), который может находиться в двух аллельных состояниях — mat a и mat α. Клетки каждого типа синтезируют половые гормоны, сигнализирующие об их присутствии клеткам второго типа, которые начинают двигаться в их направлении (M. A. Coelho et al., 2008. Identification of Mating Type Genes in the Bipolar Basidiomycetous Yeast Rhodosporidium toruloides: First Insight into the MAT Locus Structure of the Sporidiobolales).

Нашедшие друг друга клетки разных типов сливаются, при этом их ядра не объединяются — образуется дикариотическая клетка (дикарион). Дикарион многократно делится митотически, в результате формируются длинные цепочки клеток с двойными ядрами — гифы гриба. На конце гифов у криптококка образуется базидия — спорообразующая клетка, которая впоследствии даст начало спорам. В базидии происходит кариогамия (слияние ядер) и формируется диплоидное ядро. Это ядро делится мейозом, образуя четыре гаплоидные споры, которые в результате последовательных митотических делений формируют на базидии четыре длинные цепочки спор. Обязательное присутствие мейоза в жизненном цикле криптококка увеличивает генетическое разнообразие его клеток, что и позволяет им быстро развивать невероятную устойчивость к противогрибковым препаратам.

Рис. 4. Схема жизненного цикла C. neoformans: однополое и двуполое спаривание. Рисунок из статьи K. Voelz, 2010. Macrophage — cryptococcus interactions during cryptococcosis

Как выяснилось, большинство (>99%) клеток C. neoformans в природе относятся к α-типу спаривания. Казалось бы, такая асимметрия должна сильно ограничивать его способность к размножению. Но криптококки могут размножаться и путем однополого спаривания, при котором происходит слияние двух клеток одного и того же типа спаривания (α), имеющих идентичные наборы генов. При этом образующиеся диплоидные клетки формируют монокариотические гифы, на которых тоже появляются базидии, а затем происходит образование спор.

Но в чем смысл такого спаривания и чем оно отличается от обычного бесполого размножения почкованием? Как показали исследования (M. Ni et al., 2013. Unisexual and Heterosexual Meiotic Reproduction Generate Aneuploidy and Phenotypic Diversity De Novo in the Yeast Cryptococcus neoformans), в результате однополого спаривания образуются фенотипически разнообразные клетки, большинство из которых имеет анеуплоидный набор хромосом. И именно эти дочерние клетки активнее вырабатывают меланин, а также отличаются большей устойчивостью к температурам и повышенной резистентностью к противогрибковым препаратам. Удаление «лишней» хромосомы приводит к восстановлению «дикого» фенотипа, то есть к потере всех новоприобретенных свойств. Таким образом, наличие дополнительной хромосомы, из-за чего у людей может развиваться синдром Дауна и некоторые формы рака, не только не вредит криптококку, но и, напротив, повышает его вирулентность.

Китайские исследователи разработали метод количественной оценки прогресса обоих процессов — созревания базидии и мейоза. Степень созревания базидии они предложили оценивать по соотношению диаметров базидии и гифы, на конце которого эта базидия формируется. В качестве молекулярного индикатора активности мейоза ученые использовали мейоз-специфическую рекомбиназу Dmc1, связанную с флуоресцентной меткой mCherry, что позволило делать вывод о степени активности мейотического деления в базидиях по интенсивности флуоресценции. Когда исследователи проанализировали, как количественно меняются оба этих показателя в процессе споруляции, то обнаружили, что максимальная флюоресценция (то есть самый активный мейоз) и максимальные индексы созревания базидии по времени совпадают, а значит эти два процесса происходят у криптококка синхронно и скоординировано во времени.

Известно множество генов, участвующих в споруляции криптококка — геном C. neoformans достаточно хорошо изучен, поскольку этот грибок имеет важное клиническое значение, а также представляет собой удобный модельный объект для лабораторных исследований. Но какие гены отвечают именно за координацию созревания базидии и мейотическое деление? Чтобы выявить эти регуляторные гены, исследователи вначале определили 2228 генов, которые экспрессируются во время полового размножения криптококка и соотнесли их активность по времени с одной из трех стадий полового процесса: с формированием гиф, с мейозом или с постмейотической споруляцией. Учитывая тот факт, что созревание базидии и мейоз перекрываются по времени, особенное внимание исследователей уделили генам, отвечающим за синтез белка на второй стадии — во время мейоза. Именно среди этой группы (840 генов) удалось выделить регуляторные гены.

В более ранних работах (L. Wang et al., 2014. Morphotype Transition and Sexual Reproduction Are Genetically Associated in a Ubiquitous Environmental Pathogen) был описан регуляторный ген Pum1, который координирует последовательность всех этапов полового размножения криптококка. Ученые предположили, что искомые гены-координаторы базидиального созревания и мейоза должны регулироваться именно геном Pum1. Они усилили экспрессию Pum1 и вычленили восемь регуляторных генов, которые отвечали на это изменение повышением своего уровня экспрессии. При этом четыре гена оказались активны еще и во время стадии споруляции. Именно среди них стоило искать гены-координаторы мейоза и созревания базидиальной клетки. Ученые последовательно выключали эти гены и смотрели, что происходит с процессом спорообразования. В итоге удалось выявить гены, названные Csa1 и Csa2 (Cryptococcus Sporulation Activator), которые предположительно координируют мейоз и формирование зрелой базидии. У мутантов с неработающими Csa1 и Csa2 нарушались оба процесса, и в результате формирование спор полностью останавливалось.

Рис. 5. Споруляция в клетках C. neoformans, полученных в результате однополого (unisex α) и двуполого (bisex a × α) спаривания. Показаны клетки «дикого типа» (wild-type, работают оба гена — CSA1 и CSA2) и мутантные клетки, у которых отключен ген CSA1 (csa1Δ), CSA2 (csa2Δ) или оба (csa1Δ/csa2Δ). Инактивация одного или обоих регуляторных генов останавливает споруляцию. Длины масштабных отрезков — 20 мкм (в среднем ряду) и 1 мкм (в нижнем ряду). Рисунок из обсуждаемой статьи в eLife Sciences

Поскольку именно базидиоспоры — основной источник криптококкоза, исследования регуляции спорообразования может помочь научиться ограничивать распространение этой инфекции. Отключение генов, регулирующих процессы мейоза и формирования базидии, по отдельности, не приводит к полной остановке процесса спорообразования, а лишь ослабляет его. Так что выявление генетической основы согласования двух ключевых процессов в формировании спор позволяет с нового ракурса взглянуть на вопросы поиска способов борьбы со смертоносным грибком.

0
 

Коментарии:

пока нет, но вы всегда можете оставить свой.

Оставить комментарий:
captcha
Администрация оставляет за собой право удалять любые комментарии по следующим причинам:
  • Отзыв является спамом или содержит сомнительную информацию.
  • Отзыв содержит ненормативную лексику.
  • Отзыв является оскорбительным, унижающим честь и достоинство конкретных людей.
  • Сообщить о нарушении вы можете здесь